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Objectifs de la semaine 4
- Déterminer la concentration des échantillons de protéine pure dessalée de type sauvage.
- Déterminer si la protéine de type sauvage est active.
- Effectuer une SDS-PAGE des extraits de protéines mutantes ncAA exprimées lors de la semaine 3.
- Effectuer une SDS-PAGE des protéines de type sauvage purifiées.
- Purifier les protéines mutantes ncAA.
- Élaborer un dosage cinétique et déterminer les constantes catalytiques pour les enzymes de type sauvage et mutantes ncAA (voir ci-dessous les conseils de réalisation d’un dosage).
Matériel nécessaire
Détermination de la concentration en protéine
- Matériel de dosage protéique Coomassie (Bradford), contenant :
- Réactif de dosage protéique Coomassie
- Aliquotes étalonnées d’albumine bovine
Déterminer l’activité et les constantes catalytiques de l’anhydrase carbonique et de la catalase
Le matériel variera selon les groupes en fonction de la nature du dosage. Chaque groupe a la responsabilité de veiller à ce que l’équipement et le matériel nécessaires à l’exécution de leur dosage soient disponibles d’une semaine à l’autre.
Ressources et protocoles suggérés
- Concentration en protéine : Le manuel du dosage Bradford Bio-Rad peut être trouvé en ligne. http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf
- SDS-PAGE : Utiliser les ressources de la semaine 3.
- Dosage de l’enzyme : Voir les semaines 5 à 9 pour les détails des ressources concernant le dosage.
