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Méthodes de dosage des enzymes
Bien que les spécificités des dosages varient en fonction de la protéine, il est recommandé de commencer par la solution de protéine de type sauvage la plus concentrée et des réactifs mesurés grossièrement. Il est de la plus grande importance de réaliser des solutions de réserve et de noter l’ordre dans lequel les composants sont mélangés. Il est prudent de conserver des solutions de réserve de chaque composant jusqu’à ce que le comportement de chacun d’entre eux soit connu (Est-il sensible à la température? Précipite-t-il avec le temps? Détruit-il la protéine? Ou ne dure-t-il que le temps d’un cours?). Le mélange des réactifs dans une seule grande solution de réserve au début de la réalisation des dosages sacrifie une grande partie du contrôle que l’on a sur l’expérience.
Voici quelques conseils pour trouver une méthode de dosage reproductible :
- Premièrement, comment se présente la reproductibilité? Est-il possible de répéter le dosage trois fois de suite en trouvant la même vitesse initiale de réaction? Faites le test avec un mélange de dosage grossier.
- Le fait d’ajouter trop d’enzyme peut terminer la réaction avant que le mélange soit complet (c.-à-d. que la ligne de base zéro devrait changer).
- Installer la cuvette de manière incorrecte ou utiliser le mauvais type de cuvette peut être frustrant même pour les plus brillants des groupes.
- Veillez à ce que le pH soit correct et qu’il ne change pas de manière substantielle pendant la réaction.
- Lorsque vous mélangez les composants pour un dosage, essayez de ne pas utiliser de volumes inférieurs à 10 µl. En cas de besoin, pour atteindre cet objectif, faites une solution de réserve d’enzymes et de substrats plus diluée.
- Certains réactifs se décomposent (au cours d’une période de travaux pratiques) s’ils sont placés dans le tampon de dosage. Faites plutôt une solution de réserve concentrée 100x de ce réactif, et conservez-la dans l’eau ou dans un solvant de stockage sur de la glace.
- Il est possible que l’enzyme ait besoin de se réchauffer à température ambiante avant de travailler correctement.
- Un mélange incorrect peut faire apparaître des données étranges et non linéaires.
- Déterminez la longévité de l’enzyme – meurt-elle rapidement? Aura-t-elle la même activité la semaine prochaine?
Remarque : l’exemple qui suit n’est pas un dosage approprié pour vos enzymes, il s’agit simplement un exemple d’un dosage pouvant être suivi au moyen d’un spectrophotomètre!
Voici un exemple d’une réaction de dosage enzymatique pour 1 ml nécessitant un ion Zn2+. Une solution de réserve concentrée 10x de tous les composants (dissous dans un tampon de dosage) peut être réalisée.
Placez 780 ml de tampon de dosage dans une cuvette (conservé à température ambiante).
Ajoutez 100 ml de solution de ZnCl2 (10x, dans un tampon de dosage) (conservée à la température nécessaire).
Ajoutez 100 ml de solution de substrat (10x, dans un tampon de dosage) (conservée à la température nécessaire).
Mélangez.
Placez la cuvette dans l’instrument et réglez le zéro. Il peut être utile de faire exécuter à l’instrument une collecte de données complète pour voir ce qui se passe. Rien ne devrait se passer, puisque l’enzyme n’a pas encore été ajoutée. Si quelque chose change, c’est la réaction de base et il est important de la surveiller.
Ajoutez 20 ml de la solution la plus concentrée d’enzyme de type sauvage (conservée sur de la glace).
Mélangez rapidement par pipetage à l’aide d’une pipette P1000.
Recueillez les données.
Y a-t-il une activité? Oui! Gardez à l’esprit qu’il vous faudra effectuer une réaction de contrôle sans enzyme pour vous assurer que les données semblent différentes.
À présent, modifiez le dosage de manière à ce que toutes les constantes cinétiques nécessaires à la publication puissent être rassemblées et que les enzymes mutantes ncAA puissent être testées. Il peut être utile de peaufiner le dosage avant de prendre les mesures pour de bon; il est bon de décrire certains aspects, tels que le contrôle de la température et la prise de données en triple exemplaire pour les barres d’erreur, avant de prendre une série de mesures pour toutes les enzymes.
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Réflexions approfondies sur « Comment écrire un bon article? De quoi ai-je besoin pour être publié? » D’ici la fin de ce trimestre, avec un peu de chance, vous aurez été exposé à un corpus significatif de littérature concernant la protéine qui vous intéresse. À présent, il vous faut préparer votre recherche dans un manuscrit. Pensez à certains des articles que vous avez lus. Qu’avez-vous apprécié dans ces articles? Qu’est-ce que vous n’avez pas aimé? Peut-être aimez-vous que les auteurs racontent une histoire qui capte votre attention, ou que les données soient présentées de manière claire et concise. Vous pouvez vous servir de votre expérience de lecteur pour guider votre rédaction. Outre le fait de créer un manuscrit agréable à lire, il est important de prendre en compte l’utilité et la fiabilité de votre travail. Tout comme vous l’avez fait au début de ce trimestre, lorsqu’ils se lancent dans un nouveau projet, lorsqu’ils abordent un nouveau domaine de recherche ou qu’ils étudient une nouvelle technique, les scientifiques ont tendance à examiner la littérature existante pour voir ce qui a été fait et ce qui est déjà connu. À ce titre, il est important que ces articles incluent les renseignements nécessaires pour répéter ces expériences et répliquer les résultats. Le lecteur voudra également être capable d’évaluer la qualité et le sens de votre travail. Pour un travail comme un dosage cinétique, il est important de réaliser de multiples essais (dans l’idéal, trois) et d’inclure les barres d’erreur. Cela lui permet de décider si vos résultats sont dus au hasard ou s’ils sont constants et significatifs. |
