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À partir de votre solution de réserve 5x, préparez un tampon d’équilibrage 1x (50 mM de phosphate de sodium pH 7, 300 mM de NaCl) – vous aurez besoin d’environ 1 l au total pour la resuspension des cellules et le lavage du microfluidiseur entre les échantillons.

Placez les culots dans les tubes sur de la glace et resuspendez chacun d’eux complètement (pas de morceaux) dans 10 ml de solution d’équilibrage TALON 1x moins l’imidazole.  Resuspendez un culot du type sauvage et un de chacune des deux protéines mutantes ncAA (semaine 3).  Emmenez vos cellules resuspendues sur glace, votre flacon de tampon d’équilibrage 1X et vos tubes de centrifugation Oakridge au laboratoire central en ALS 2124.  Votre auxiliaire à l’enseignement vous montrera comment utiliser le microfluidiseur.  Nous enverrons les groupes un par un.  Pour terminer l’expérience à temps, vous devrez effectuer la microfluidisation pendant la première heure de travaux pratiques.  Les groupes ne seront pas autorisés à commencer la microfluidisation après la première heure.  Vous devrez également avoir terminé d’éluer la protéine de la résine avant la fin de la période de travaux pratiques.  Travaillez de manière efficace!

Une fois que vous avez récupéré vos cellules lysées, retournez au laboratoire d’enseignement BB et centrifugez vos échantillons dans le rotor Sorvall SS34 à 18 000 tours/minute pendant 20 minutes, à 4 °C.  Veillez à bien équilibrer les tubes d’abord.

Préparation de la résine TALON et fixation de l’échantillon :

Pendant que les cellules microfluidisées centrifugent, préparez et lavez la résine d’affinité pour les métaux BD TALON, en suivant le protocole décrit dans le manuel TALON (spécifiquement le protocole concernant la purification du type sauvage à pH 7).  Le manuel inclut également la quantité recommandée de volume de lit de résine à utiliser – anticipez qu’il y aura au moins 20 mg de protéine pour 100 ml de culture pour la protéine de type sauvage (la production varie en fonction de la stabilité de chaque protéine et de l’efficacité de la machinerie de traduction, donc chaque site TAG sera différent en fonction de son emplacement et des ncAA incorporés).  Une fois que la résine a été lavée et combinée à l’échantillon dans un tube Falcon de 50 ml, liez l’échantillon à la résine pendant au moins 30 minutes (à température ambiante ou plus froide) par agitation.  Une fois l’échantillon lié, il peut soit être lavé en lots ou être appliqué à la colonne et lavé abondamment (2 x 10 ml environ).  Le degré de lavage peut être surveillé grâce à une coloration de Bradford Coomassie – si une couleur bleue apparaît lorsque 500 ml de coloration sont combinés avec 20 ml d’éluant, alors il est probable que des protéines sans étiquette poly-histidine soient encore en train d’être lavées de la résine.  Lorsqu’aucune couleur bleue n’apparaît, éluez la protéine purifiée avec 1,5 à 2 ml de tampon d’élution.  C’est un volume pratique à utiliser pour l’étape suivante, le dessalage.

• CONSEIL : Ajouter les 1,5 à 2 ml de tampon d’élution à la résine en plus petites quantités a tendance à améliorer le rendement de protéine purifiée.

Stockez les fractions de protéine éluée à 4 °C (pas congelées!) ou sur de la glace jusqu’à ce que vous soyez prêt à passer à l’étape suivante.

Pour dessaler l’échantillon de protéine dans le tampon de stockage, suivez la procédure décrite dans le manuel des colonnes de dessalage PD-10.  Prévoyez environ 20 minutes pour laver la colonne de dessalage avec le tampon de stockage.  Vous devrez peut-être le faire pendant la séance de laboratoire suivante.

Méthode de destruction des cellules par sonication (méthode de rechange) :

Placez les culots sur de la glace et ajoutez une quantité appropriée de tampon de lavage.  Combinez tous les culots du même type protéique (c.-à-d. le type sauvage par opposition aux deux types de culots de protéines mutantes ncAA) dans un seul tube conique de 50 ml.

• CONSEIL : Puisque les cellules resuspendues devront au final être centrifugées dans des tubes propres aux grandes vitesses qui contiennent 40 ml, veillez à ce que le volume total utilisé pour la resuspension des culots n’excède pas 40 ml, afin que tous les culots d’un même type puissent être dans le même tube. Utilisez 15 ml de tampon de lyse pour 25 ml de culot de cellule.

Une fois les culots combinés, ajoutez 20 mg de lysozyme (sans excéder une concentration totale en lysozyme de 1 mg/ml) aux cellules resuspendues.  Mélangez le lysozyme dans la solution par inversion douce seulement – ne pas secouer, faire mousser (c.-à-d. en y incorporant de l’air) ou réchauffer les échantillons, la protéine pouvant être instable lorsqu’elle est exposée à l’air ou à la chaleur.  Toute partie restante de culot peut être resuspendue par une brève sonication.

Pour lyser les cellules de manière plus complète, vous pouvez utiliser la sonication.  La sonication rompt les parois des cellules à peu près de la même manière que le fait de se tenir près d’une enceinte à un concert peut rompre les tympans. Par conséquent, des protections auditives devront être portées pendant toute la durée de ce processus.  Utilisez le réglage de puissance le plus élevé pour soniquer l’échantillon sans le faire mousser.  Bouger l’extrémité du sonicateur près de la surface de la solution la fera mousser, et lui faire toucher le tube de plastique l’empêchera de lyser correctement les cellules. Ne faites pas de sonication dans un contenant en verre. La sonication de chaque échantillon pendant trois intervalles d’une minute devrait être suffisante. Ne laissez pas le sonicateur réchauffer l’échantillon à une température supérieure à la température ambiante – si l’échantillon commence à chauffer, arrêter la sonication jusqu’à ce qu’il soit refroidi.

Pour éliminer les débris cellulaires, les échantillons doivent être centrifugés vraiment rapidement dans des tubes conçus pour grandes vitesses munis de bouchons.  Après vous être assuré que les tubes soient bien équilibrés dans le rotor (vérifiez avec une balance) et qu’ils ne soient pas fissurés ou que leur structure ne soit pas fragilisée, faites-les tourner aussi vite que la centrifugeuse le permet pendant 30 minutes.