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Votre objectif est de concevoir une étude scientifique significative autour de l’un des enzymes qui ont été choisis pour vous : l’anhydrase carbonique II humaine thermostable ou la catalase HPII d’E. coli.  Traditionnellement, les biochimistes peuvent remplacer n’importe quel acide aminé d’une protéine par n’importe quel autre acide aminé naturel grâce à des méthodes de mutagenèse standard. Cette méthode est courante pour faciliter la compréhension du fonctionnement d’une protéine (régulation, liaison, etc.) et pour améliorer son utilité pour d’autres applications (stabilité, activité, etc.).  Nous allons rompre avec cette tradition et vous permettre de sélectionner de nouvelles structures d’acides aminés (acides aminés non canoniques) pour étudier les protéines d’une manière qui n’était pas possible auparavant. Il serait possible de placer les ncAA n’importe où dans la protéine au moyen de l’expansion du code génétique, mais en raison des contraintes de temps de la mutagenèse, nous sommes obligés de ne sélectionner que certains sites pour que vous puissiez les explorer. La clé de cette activité est de déterminer ce qui est important dans les sites que nous avons sélectionnés pour vous en termes de stabilité, d’activité, de régulation des protéines ,etc., puis de choisir parmi les nouvelles capacités chimiques des ncAA pour développer une étude scientifique significative qui n’a jamais été possible auparavant.

En utilisant la liste des sites de mutation et des ncAA disponibles fournie par l’enseignant (annexe 6), choisissez un ou deux sites à explorer par l’incorporation des ncAA.  Vous serez en mesure de produire deux nouvelles protéines mutantes à étudier en parallèle de la protéine de type sauvage. Une recherche documentaire sur votre enzyme spécifique peut mettre en évidence des résidus particuliers dans cette enzyme qui sont censés influer sur la structure ou la fonction de la protéine.  Examinez attentivement les propriétés chimiques (c.-à-d. la chaîne latérale de l’acide aminé de type sauvage) qui existent déjà dans les sites et les nouvelles propriétés qui peuvent être introduites par les ncAA.  Le site peut-il être un facteur dans la catalyse de l’enzyme?  Est-il responsable du maintien des caractéristiques structurelles de la protéine ou participe-t-il à la transmission des changements structurels à différentes zones de la protéine?  Il s’agit d’aspects importants à prendre en compte lors de la sélection des sites et des ncAA qui seront étudiés pendant toute la durée du semestre. Votre étude doit s’inscrire dans le contexte de la littérature scientifique.

Pour faciliter la production et la purification des protéines mutantes ncAA choisies, les gènes pertinents – la variante thermostable de l’anhydrase carbonique II humaine (CA) et la catalase HPII (HPII) d’E. coli – ont été synthétisés commercialement pour optimiser leur utilisation des codons pour l’expression dans E. coli.  Les deux gènes ont été clonés dans le plasmide d’expression pBad. Le clonage supprime le codon STOP et ajoute une étiquette d’affinité riche en histidine à la terminaison C, ce qui permet de purifier facilement le produit protéique.  Un codon STOP (TAG) a ensuite été incorporé à la place d’un codon dans le gène de type sauvage en utilisant des amorces mutées.  Ces deux plasmides, l’un contenant le gène de type sauvage et l’autre la mutation TAG, permettront de produire respectivement une version de type sauvage et une version mutante ncAA de la protéine.  Chaque groupe effectuera des études comparatives de la structure et de la fonction de l’ensemble des protéines pures, de type sauvage et mutante ncAA.  Les séquences génétiques pertinentes pour chaque protéine se trouvent dans les tableaux correspondants de l’annexe 2 et les structures ncAA disponibles se trouvent à l’annexe 3.  En utilisant ces séquences génétiques, il est possible de faire une estimation du poids moléculaire et de la séquence du produit protéique à l’aide de la ressource Web fournie.  Ces données seront utiles pour les étapes ultérieures du processus de purification.

Matériel nécessaire (à obtenir pour la semaine 2)

Équipement

• Fioles stériles avec déflecteurs de 250 ml (1 pour la protéine de type sauvage)
• Embouts de pipette stériles
• Bouteilles et fioles stériles (250 ml)
• Microtubes à centrifugation stériles de 1,7 ml
• Tubes à culture à fond rond stériles de 14 ml pour l’expression du contrôle positif sfGFP

Préparation de cultures (la composition des milieux sera préparée et aliquotée par les assistants d’enseignement)

• H₂O stérile (traitée à l’autoclave dans un volume de 250 ml)
• Aspartate (5 %, pH de 7,5; ajuster le pH avec du NaOH, pour autoclave)
• Glycérol (10 % poids/volume; pour autoclave)
• Mélange de 18 AA (25x) (conservé à 4 °C)
• Sels minéraux 25x (« 25 x M »)
• Arabinose (20 % poids/volume, filtre stérile)
• MgSO₄ (1 M; pour autoclave)
• Glycérol (40 % poids/volume; pour autoclave)
• Solution de réserve de métaux traces (5 000x)
• Ampicilline (réserve 1 000x) (100 mg/ml dans H₂O; filtre stérile) (conservée à -20 °C)
• Tétracycline (réserve 1 000x) (25 mg/ml dans du DMF) (conservée à -20 °C)
• NaOH, 8 M
• Acides aminés non canoniques pertinents (sous forme de poudre)

Ressources et protocoles suggérés

• Étalonnage des micropipettes : voir l’annexe 1.
• PyMOL http://pymol.org/edu/ et didacticiel PyMOL http://www.pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners
• Banque de données sur les protéines http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do
• Programme PyMOL sur la structure cristalline : Dans la banque de données sur les protéines (ou PDB) en ligne, trouvez le fichier des protéines de type sauvage : l’anhydrase carbonique II humaine thermostable ou la catalase HPII d’E.coli. http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do
• Détermination des séquences de protéines et calcul du poids moléculaire des protéines : http://db.systemsbiology.net:8080/proteomicsToolkit/
• Préparation des milieux et expression des protéines : Les grandes lignes de cette procédure sont présentées à la semaine 2. Pour une discussion plus approfondie sur la production, le contrôle et la purification des protéines mutantes ncAA, voir l’article suivant, disponible sur Canvas :

HAMMILL, J.T., S. MIYAKE-STONER, J.L. HAZEN, J.C. JACKSON, R.A. MEHL.  Preparation of site-specifically labeled fluorinated proteins for 19F-NMR structural characterization, 2007,  Nature Protocols, vol. 2 n^o 10, p. 2 601 à 2 607.