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Concepts pour l’électrophorèse SDS-PAGE
Avant d’analyser des échantillons de protéines par électrophorèse sur gel, il est utile de connaître la position prévue des bandes sur le gel en calculant la taille prévue de la protéine. Le chapitre 6 de Voet et Voet décrit les principes de base de SDS-PAGE. Connaître la taille prévue des bandes est également important lors de la sélection de la concentration de polyacrylamide que le gel doit contenir, puisque différents niveaux de polyacrylamide sont plus efficaces pour séparer différents intervalles de tailles de protéines. Les sources Molecular Cloning (qui traitent également de la coloration utilisée dans ce processus, Coomassie G-250) et le manuel Bio-Rad sont également de bonnes ressources pour les principes de l’électrophorèse sur gel.
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Réflexions approfondies sur les contrôles À quoi sert un contrôle? Généralement, un contrôle peut être utilisé pour vérifier que votre système se comporte comme vous l’attendez. De plus, un contrôle peut être utilisé pour déterminer ce qui se passe lorsque quelque chose ne va pas dans votre expérience, le cas échéant, et le corriger. Dans ce travail pratique, vous serez amené à utiliser des contrôles dans au moins deux contextes : l’expression des protéines (pour l’incorporation de ncAA) et les dosages. Y a-t-il d’autres contrôles que vous devriez intégrer à vos expériences? Pour l’expression de votre protéine, vous devez mettre en place des contrôles positifs et négatifs. Que sont ces contrôles? Quels résultats espérez-vous observer pour vos contrôles positifs et négatifs? Si vos contrôles s’éloignent de cette attente, qu’est-ce qui l’explique? Avez-vous besoin de contrôles de purification? Pour votre dosage, un contrôle est un moyen important de vérifier que l’activité observée provient de votre protéine et non d’une autre source. Comment mettre en place ce contrôle? Ce n’est pas grave si une certaine activité est observée lors de votre contrôle (on l’appelle couramment « réaction de base »). Dans un tel cas, comment pourriez-vous utiliser les résultats de ce contrôle? |
Matériel nécessaire pour SDS-PAGE
Équipement
- Plaques en verre, support pour coulage, pinces pour coulage et peigne
- Plateaux de gel (avec séparateurs)
- Conseils de chargement du gel
- Bouteilles pour tampon de migration 1x
- Conteneurs de stockage de gel en plastique (un par groupe)
- pH-mètres – stations communes.
SDS-PAGE – voir le guide Bio-Rad SDS-PAGE pour les gels en Laemmli discontinus du système Mini Protean II
- Solution de polyacrylamide à 30 % (Attention : neurotoxine – porter des gants, des lunettes, une blouse) (aliquotes fournies)
- TEMED (acheté comme solution)
- Persulfate d’ammonium – 10 % en poids/vol dans l’eau; fraîchement préparé tous les jours (1 ml)
- Tampon de gel de séparation (1,5 M de Tris pH 8,8) (préparez 100 ml)
- Tampon de gel de concentration (0,5 M de Tris pH 6,8) (préparez 100 ml)
- 10 % de solution SDS (préparée pour vous)
- Colorant de charge SDS 2x, pH 6,8 (contient 125 mM de Tris-HCl, 4 % de SDS, 20 % de glycérol, 0,02 % de bleu de bromophénol et 5 % de β mercapto-éthanol) (10 ml)
- Tampon de migration 10x pour SDS-PAGE, pH 8,3 (contient 250 mM de Tris base, 1,92 M de glycine et 1 % de solution SDS dans l’H2O distillée) (préparez 500 ml)
- Marqueurs de poids moléculaire (Bio-Rad Precision Plus Dual Color; charger 5 à 7,5 µl dans une piste; conserver l’aliquote à -20 °C)
- Échantillons ponctuels dans le temps (culot cellulaire centrifugé à partir de 250 ml de chaque expression)
- Solutions de coloration/décoloration : seront fournies pour le cours à un poste sous la hotte.
- Coloration bleu de Coomassie brillant G-250
- Méthanol 40 %
- Acide acétique 10 %
