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Concepts de dosage des enzymes
En bref, un dosage enzymatique consiste à prendre une enzyme et à la recombiner avec les matériaux de départ. Il est par conséquent nécessaire d’avoir un moyen de contrôler la disparition des matériaux de départ ou la formation des produits. Si l’enzyme augmente effectivement la vitesse de la réaction, alors la formation de produits sera notablement plus rapide avec l’enzyme que sans l’ajout de l’enzyme. Le catalyseur utilisé ici provenant d’un organisme vivant, il est sensible à la concentration en sel, au pH et aux concentrations des matériaux de départ et des produits. La littérature concernant la protéine peut fournir des données utiles à propos de ces valeurs.
Ne vous inquiétez pas lorsque vous commencez les dosages bruts initiaux – il est fort peu probable que cela semble juste au premier essai. Il existe trop de facteurs qui auront besoin d’être ajustés pour obtenir des données correctes. Lorsque vous commencez, laissez bien au dosage l’occasion de montrer une activité catalytique, sans perdre de temps avec la précision des mesures et l’élaboration de solutions de réserve.
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Réflexions approfondies sur la cinétique et les dosages Vous comparerez au moins la cinétique de votre protéine native à celle des protéines mutantes ncAA au moyen d’un dosage. Mais que signifient en fait ces changements dans les paramètres cinétiques et comment interprétez-vous vos résultats? Interpréter vos résultats d’une manière significative est peut-être l’une des parties les plus difficiles de vos expériences. Revoyons tout d’abord certaines valeurs cinétiques fondamentales. KM est la constante de Michaelis et représente la concentration du substrat à 1/2 Vmax. Vmax est la vitesse maximale de l’enzyme. kcat est le nombre de rotations et mesure le nombre de molécules de substrat converties par molécule d’enzyme par seconde. Le rapport kcat/KM est souvent utilisé comme mesure de l’efficacité catalytique. Comment allez-vous obtenir ces valeurs (et peut-être d’autres) en vous servant de votre dosage cinétique? Nous supposons généralement que les enzymes suivent la cinétique de Michaelis-Menten, mais est-ce bien le cas pour votre enzyme? Quel est le modèle le plus adapté à la cinétique de votre enzyme et comment a-t-il été modélisé dans la littérature? Pour évaluer la cinétique de vos protéines, à quels moments et pendant combien de temps devez-vous prendre vos mesures? Quels autres facteurs devez-vous prendre en compte afin de réaliser un dosage cinétique précis et constant? Par exemple, quelle influence la température, le pH et la composition du tampon ont-ils sur votre dosage? Quelles variables doivent rester constantes, et quelles variables doivent changer à mesure que vous effectuez votre dosage? (Si votre enzyme suit la cinétique de Michaelis-Menten, la concentration de l’enzyme doit rester constante tandis que la concentration du substrat doit changer). Une fois que vous avez vos résultats, qu’en faites-vous? Comment pourriez-vous évaluer la précision et la validité de vos mesures? Vos résultats sont-ils cohérents entre eux et ont-ils un sens? Vous pourriez également réussir à trouver dans la littérature les paramètres cinétiques acceptables pour votre protéine native. Qu’est-ce qui vous permet d’établir une comparaison significative entre vos valeurs et celles trouvées dans la littérature? Que signifient les changements des divers paramètres cinétiques? |
Matériel nécessaire
- Le matériel variera selon les groupes en fonction de la nature du dosage. Chaque groupe a la responsabilité de veiller à ce que l’équipement et le matériel nécessaires à l’exécution de leur dosage soient disponibles d’une semaine à l’autre.
Ressources et protocoles suggérés
- Renseignements généraux sur le dosage : Le chapitre 1 du livre Enzyme Assays d’Eisenthal et Danson couvre une grande partie des bases nécessaires pour effectuer des dosages et des mesures cinétiques. Vous en trouverez un exemplaire dans le laboratoire d’enseignement.
