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Méthodes pour les courbes étalons de protéines et l’électrophorèse SDS-PAGE
La méthode permettant de générer une courbe étalon et de mesurer les concentrations d’échantillons est décrite clairement dans le manuel de dosage Bradford. Anticipez un intervalle de travail de 100 à 1 500 µg/ml de protéine. Des échantillons d’albumine sérique bovine étalonnée seront fournis.
Attention : La solution Bradford Coomassie est un acide très fort (acide phosphorique) – faites preuve d’une grande prudence lorsque vous l’utilisez et, en cas d’exposition, lavez immédiatement à l’eau claire. Recueillez le réactif usagé dans un contenant à déchets approprié dans la hotte de laboratoire.
Lorsque vous préparez et réalisez le gel SDS-PAGE de l’échantillon de protéine purifiée, la seule différence réside dans la préparation de l’échantillon. Environ 5 à 20 µl de l’échantillon de protéine dessalée peut être mélangé à 20 µl de SDS 2x, qui peut alors être chauffé à 100 °C pendant 5 à 10 minutes. Centrifugez brièvement les tubes afin que la totalité de l’échantillon se retrouve dans la partie inférieure du tube. 20 µl de ce mélange peuvent être ajoutés aux puits du gel. Une règle empirique pour les mini gels consiste à ajouter environ 0,5 microgramme de protéine par bande attendue, de manière à ce que le gel ne soit pas surchargé.
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Réflexions approfondies sur la concentration de protéines Il existe de nombreuses manières permettant de mesure une concentration en protéine, et comme c’est souvent le cas, chacune a ses avantages et ses inconvénients. Comment mesurez-vous la concentration en protéine? Les réactifs pour un dosage Bradford sont fournis, mais vous devez quand même vous demander si c’est la meilleure méthode pour mesurer la concentration de votre protéine. Outre le dosage Bradford, deux des moyens les plus courants pour déterminer une concentration en protéine sont le dosage protéique BCA et l’absorbance à 280 nm en utilisant un Nanodrop ou un Picodrop. Différentes choses sont à prendre en considération lorsqu’on sélectionne une méthode : la compatibilité avec le type d’échantillon et les composants de la solution tampon (notamment le zinc ajouté), l’intervalle de dosage et le volume d’échantillon requis, la vitesse et la praticabilité par rapport au nombre d’échantillons à tester, la disponibilité d’un spectrophotomètre ou d’un lecteur de microplaques pour mesurer l’absorbance par le dosage, l’utilité pour la mesure du lysat de cellule entière ou la protéine pure, l’uniformité (quelle variation y a-t-il d’une protéine à l’autre?) et si on l’utilise, l’adéquation de l’étalon. Dans le cas qui vous concerne, il faudra également prendre en compte l’effet que l’ajout d’un acide aminé non canonique à votre protéine pourrait avoir sur vos mesures. Le dosage Bradford se fonde sur la liaison proportionnelle de la coloration Coomassie aux protéines. Dans les limites de l’intervalle linéaire du dosage, plus il y a de protéines, plus la coloration Coomassie se lie, et plus la couleur devient foncée. La coloration Coomassie absorbe à 595 nm, donc en utilisant un étalon de protéine, le plus souvent l’albumine bovine sérique (BSA), vous pouvez générer une courbe étalon et l’utiliser pour mesurer les concentrations en protéine de vos échantillons. Le dosage protéique BCA est également un dosage colorimétrique utilisé pour quantifier une concentration en protéines. La méthode se base sur la réduction du cuivre et la détection consécutive du cuivre réduit par le BCA (acide bicinchoninique). Ce complexe cuivre/BCA présente une absorption linéaire forte à 562 nm avec des concentrations en protéines croissantes. Comme avec le dosage Bradford, un étalon de protéine, le plus souvent l’albumine bovine sérique, est utilisé pour générer une courbe étalon avec laquelle vous pourrez déterminer les concentrations en protéines de vos échantillons. Un Nanodrop est un spectrophotomètre de laboratoire courant qui peut être utilisé pour déterminer les concentrations en protéines, en ADN et en ARN. Pour mesurer une concentration en protéines, le Nanodrop utilise l’absorbance à 280 nm, souvent appelée A280, et un coefficient d’extinction pour déterminer la concentration d’un échantillon de protéine pure. Qu’est-ce qu’un coefficient d’extinction? Un coefficient d’extinction est une constante, pour une protéine, qui reflète la quantité de lumière ultraviolette qu’elle va absorber en fonction de sa composition en acides aminés, les acides aminés aromatiques étant les principaux responsables de l’absorption de la lumière ultraviolette. L’avantage du Nanodrop est qu’il ne nécessite que des échantillons de toute petite taille (~1-2 µl) et qu’il est rapide. |
