11
11
Concepts de purification et de dessalage des protéines
La queue polyhistidine permet une purification de la protéine d’intérêt à partir d’autres protéines à l’aide d’une résine d’affinité métallique. Il est important d’utiliser la bonne quantité de résine : une trop grande quantité peut se lier sans discernement à des protéines dépourvues de queue polyhistidine, ce qui donne des protéines impures, tandis qu’une quantité insuffisante entraîne la perte d’une partie de la protéine souhaitée lorsque la résine est surchargée, ce qui réduit le rendement.
Le tampon d’élution utilisé pour éluer la protéine marquée à la polyhistidine au cours de la procédure de purification (contenant du phosphate de sodium, du chlorure de sodium et de l’imidazole) n’est probablement pas un tampon optimal pour vos dosages. Par conséquent, la protéine doit être retirée du tampon d’élution et placée dans un tampon de stockage ou de dosage. Le concept de la méthode de purification utilisée pour dessaler les échantillons de protéines – la chromatographie par filtration sur gel – est important à comprendre. Ses principes sont décrits au chapitre 5 de Mathews, Van Holde, Appling et Athony-Cahill ou au chapitre 6 de Voet et Voet.
|
Réflexions approfondies sur les tampons Vous avez passé beaucoup de temps à en apprendre sur les tampons et le pH en classe depuis l’école secondaire. Mais vous souvenez-vous de ce qu’est un tampon et de sa fonction? Si ce n’est pas le cas, peut-être voudrez-vous revoir le tout avant de continuer. Vous avez déjà utilisé et créé une variété de tampons, mais qu’est-ce qui fait un bon tampon? Par exemple, les tampons pour la purification par SDS-PAGE et par affinité polyhistidine ont prescrit des recettes optimisées pour chaque objectif précis. Maintenant, c’est à vous de sélectionner et de créer vos propres tampons pour vos expériences. À tout le moins, vous devrez sélectionner un tampon adapté au stockage de vos protéines à dessaler. Dans ce cas, qu’est-ce qui constitue un bon tampon? Ça dépend des qualités que vous souhaitez dans votre tampon. Dans ce cas, vous voulez probablement un tampon dans lequel votre protéine est stable. Afin d’éviter de changer à nouveau les tampons, vous souhaiterez probablement également un tampon qui n’interférera pas avec le dosage de votre choix. Il peut y avoir des qualités supplémentaires à prendre en compte lors du choix et de la fabrication de votre tampon. |
|
Réflexions approfondies sur la purification des protéines Les protéines peuvent être purifiées de différentes manières. Dans ce cours, nous utilisons l’une des méthodes les plus simples et les plus courantes pour purifier les protéines exprimées par recombinaison : la purification par affinité avec la polyhistidine. Comment cette méthode fonctionne-t-elle réellement? De quoi dépend-elle pour fonctionner efficacement? Si vous rencontrez des problèmes avec votre système de purification, quel pourrait être le problème et comment le résoudre? De nombreuses techniques de purification autres que la purification par affinité avec la polyhistidine peuvent être utilisées. Elles s’appuient sur la taille, la charge ou l’affinité d’autres molécules comme technique de purification de substitution ou en complément de la purification par affinité avec la polyhistidine, afin d’obtenir un échantillon plus pur. Quelles sont ces techniques? Quelles sont les conditions requises pour purifier efficacement votre protéine d’intérêt et quels sont les avantages et les inconvénients de leur utilisation? |
Matériel nécessaire
Équipement
- Microfluidiseur (offert pour BB494)
- Sonicateur avec source d’énergie et protection auditive (autre méthode de lyse)
- Tubes à centrifugation haute vitesse Oak Ridge
- Rotor Sorvall SS34
- Colonnes poly-prep – Bio-Rad (réutilisables)
- Colonnes de dessalage PD-10 préemballées de GE Health Care – à réutiliser.
Purification et dessalage des protéines
- Résine d’affinité métallique BD TALON BD (les équipes recevront une aliquote de résine dans un tampon de conservation à long terme. La résine devra être équilibrée).
- Tampons d’équilibrage TALON 5x (250 mM de phosphate de sodium, 1,5 M de NaCl pH 7,0). Remarque importante : Pour l’utilisation du microfluidiseur, préparez une réserve de 0,5 l à 5x. Si nécessaire, diluez à 1x à chaque purification.
- Tampon d’équilibrage ou de lavage TALON 1x à pH 7,0 (50 mM de phosphate de sodium, 300 mM de NaCl) (également appelé tampon Tractor dans le manuel TALON)
- Tampon d’élution TALON, pH 7,0 (50 mM de phosphate de sodium, 300 mM de NaCl, 250 mM d’imidazole) (préparez 100 ml ou moins)
- Lysozyme de blanc d’œuf de poule T4, si sonication
- Culots cellulaires provenant d’expressions centrifugées
- Réactif Bradford pour le dosage des protéines et protéine standard d’albumine de sérum bovin
Ressources et protocoles suggérés
- Préparation du tampon de purification de protéines : Le manuel des résines d’affinité métallique TALON est accessible sur le site Canvas. Remarque : Le manuel TALON fait référence au tampon Tractor – vous fabriquerez vos propres tampons d’équilibrage, de lavage et d’élution de résine TALON (voir la liste ci-dessus).
- Dessalage des protéines : Le manuel d’utilisation des colonnes de dessalement PD-10 peut être téléchargé à partir du site Web du fabricant et est également accessible sur Canvas.
http://www6.gelifesciences.com. (lien inactif au 19/5/2021) Sélectionnez un tampon pour le dessalage qui soit compatible avec vos dosages. Assurez-vous de bien comprendre le concept général et l’utilisation des termes « tampon d’équilibrage » et « tampon d’élution ».
|
Réflexions approfondies sur la stabilité des protéines La stabilité des protéines est applicable à ce cours de multiples façons. Tout d’abord, vous devez tenir compte de la stabilité de votre protéine dans le temps dans le cadre de vos expériences. Ensuite, la stabilité (dans le temps ou peut-être la thermostabilité) peut être une caractéristique de votre enzyme que vous voudrez évaluer dans le cadre de votre recherche. Les changements de stabilité présentent souvent un intérêt et l’augmentation de la thermostabilité est généralement un résultat souhaité lors de la conception d’une enzyme. Premièrement, nous nous pencherons sur la stabilité pour ce qui est du maintien de l’intégrité de votre protéine. Vous exprimerez et purifierez votre protéine native dès la troisième semaine du semestre. Pensez-vous que cette protéine purifiée aura la même activité et se comportera de la même manière lors de vos dosages finaux de la semaine 9? Que pouvez-vous faire pour maintenir l’intégrité de vos protéines dans le temps? Un facteur essentiel à prendre en compte est la manière dont votre protéine est stockée; il est primordial de comprendre et de choisir les conditions dans lesquelles votre protéine peut être conservée sans perte appréciable d’activité pour pouvoir l’évaluer de manière efficace. Afin de maintenir une activité maximale et d’obtenir des résultats cohérents d’une période de laboratoire à l’autre, comment devez-vous stocker vos protéines? À quelle température? Dans un tampon? À quelle concentration? Comment devez-vous manipuler votre protéine lorsque vous l’utilisez? Si vous observez une perte d’activité avec le temps, qu’est-ce qui pourrait entraîner cette réduction d’activité? Que pourriez-vous faire pour atténuer la perte d’activité? Que pourriez-vous faire pour limiter l’effet de la perte d’activité de votre protéine dans le temps sur vos résultats? Outre la mesure de l’activité réduite, comment pourriez-vous détecter que l’intégrité de votre protéine diminue avec le temps? Par ailleurs, si vous souhaitez évaluer la stabilité de votre protéine en tant que caractéristique supplémentaire, comment pouvez-vous vous y prendre? Qu’est-ce qu’un dosage approprié et comment pouvez-vous tester votre enzyme? |
