6
6
Concepts d’expression des protéines
Les protéines appropriées seront produites en faisant croître des cultures de cellules d’E. coli DH10B, qui contiennent différents plasmides utilisés en fonction de la capacité requise. Pour s’assurer que seules les cellules contenant les plasmides appropriés peuvent croître dans le milieu, elles doivent être cultivées en présence d’antibiotiques. La protéine de type sauvage sera produite à partir d’un plasmide pBad (pBad-gène), et les cellules contenant pBad doivent être cultivées en présence d’ampicilline. La protéine ncAA-mutante sera également produite à partir d’un plasmide pBad, qui contient le même gène mais avec un site TAG à l’un des codons (pBad-TAG-gène). De plus, pour produire des protéines avec des acides aminés non canoniques, il faut également ajouter une machinerie de traduction non naturelle. Cette machinerie non naturelle se trouve sur le plasmide pDule-RS, et les cellules contenant pDule doivent être cultivées en présence de tétracycline. En outre, l’acide aminé non canonique doit être ajouté dans le milieu parce que les cellules d’E. coli ne produisent pas naturellement les ncAA. Par conséquent, alors que les cellules productrices de protéines de type sauvage ne doivent être cultivées qu’en présence d’ampicilline pour produire des protéines de type sauvage, les cellules productrices de protéines mutantes ncAA devront être cultivées avec de l’ampicilline, de la tétracycline et l’acide aminé non canonique dans le milieu afin de produire la protéine mutante ncAA.
En tant que contrôle supplémentaire pour la surveillance de la production des protéines, l’expression de contrôles négatifs doit être exécutée pour chaque type de ncAA utilisé. Ces expressions permettent de s’assurer qu’aucun acide aminé naturel n’est utilisé par la synthétase et inséré dans le site TAG. L’expression des contrôles négatifs se fait en l’absence de ncAA dans le milieu; par conséquent, seules des protéines tronquées devraient être produites par ces expressions. En tant que contrôle positif pour votre média, vous exprimerez des cultures de 5 ml de la protéine fluorescente verte superfolder (sfGFP). Ces cellules contiendront uniquement le plasmide pBad-sfGFP (amp seulement) et deviendront vertes si le milieu a été préparé correctement.
Après environ 24 à 48 heures d’expression, les cultures cellulaires de grand volume devraient être saturées avec des cellules qui ont été induites pour surexprimer la protéine d’intérêt. La séparation des cellules du milieu et le stockage des culots cellulaires à -80 °C une fois l’expression terminée permettront de purifier ultérieurement la protéine à partir des cellules.
Remarque : Cette année, nous réalisons séparément l’expression et la purification des protéines de type sauvage et des protéines mutantes ncAA pour vous permettre de passer plus de temps à comprendre votre protéine et à développer une hypothèse expérimentale. Les équipes vont simplement faire pousser des cultures de leur protéine de type sauvage et d’un contrôle sfGFP pendant la semaine 2, puis l’ensemble des protéines de type sauvage et mutantes ncAA pendant la semaine 3. Dimensionner les composants du milieu de manière appropriée.
N’oubliez pas que ces instructions pour les volumes à préparer sont des lignes directrices : assurez-vous de comprendre les principes et de pouvoir ajuster la quantité de milieux que vous préparez et le volume de cultures que vous cultivez de manière adéquate. Ne préparez pas plus de milieux que nécessaire pour l’expression de cette semaine.
Matériel nécessaire
Équipement pour expression en cultures de 50 ml
- Fioles stériles avec déflecteurs de 250 ml (une pour le type sauvage, deux pour les protéines mutantes ncAA)
- Deux tubes à culture stériles pour l’expression du contrôle négatif
- Bouteilles stériles (150 ml, 250 ml, 500 ml)
- Embouts de pipette stériles
- Grande centrifugeuse
- Microcentrifugeuse
- Microtubes à centrifugation stériles de 1,5 ml
- Microtubes à centrifugation de type Oakridge
- Tubes à centrifugation coniques stériles de 50 ml
- Agitateur (température réglée à 37 °C)
- Pinces pour agitateur (3 petites) pour chaque groupe; les assistants et les enseignants les fourniront
Préparation des cultures :
- Cultures de cellules de départ appropriées cultivées dans des milieux non inductifs (voir l’annexe 4)
- H2O stérile
- Aspartate (5 %, pH 7,5)
- Glycérol (10 %)
- Mélange de 18 AA (25x) (conservé à 4 °C)
- Sels minéraux (25x)
- Arabinose (20 %) (conservé à 4 °C)
- MgSO4 (1 M)
- Glucose (40 %)
- Métaux traces (5 000x)
- Ampicilline (réserve 1 000x) (100 mg/ml dans H2O) (conservée à -20 °C)
- Tétracycline (réserve 1 000x) (25 mg/ml dans du DMF) (conservée à -20 °C)
- NaOH 8 M
- Acides aminés non canoniques d’intérêt
Ressources et protocoles suggérés
- Préparation des milieux et expression des protéines : Les grandes lignes de cette procédure sont présentées ci-dessous. Pour une discussion plus approfondie sur la production, le contrôle et la purification des protéines mutantes ncAA, voir l’article suivant :
Hammill, J.T.; Miyake-Stoner, S.; Hazen, J.L.; Jackson, J.C; Mehl, R.A. (2007) Preparation of site-specifically labeled fluorinated proteins for 19F-NMR structural characterization. Nature Protocols, vol. 2 no 10, p. 2 601 à 2 607.
- Sélection des gels de polyacrylamide : La ressource suivante de Bio-Rad contient des concepts pertinents pour l’électrophorèse des protéines sur gel et peut être trouvée dans la zone de ressources de la littérature sur Canvas :
|
Réflexions approfondies sur l’exploitation du dogme central Les détails de base de l’expansion du code génétique sont indiqués dans la partie « Contexte » de ce manuel de laboratoire. Le but de l’expansion du code génétique est d’incorporer un acide aminé non canonique dans un site spécifique dans une protéine de votre choix. Comment ça marche exactement? Comment le code génétique est-il facilité par l’ARNt? Qu’est-ce que l’anticodon sur l’ARNt orthogonal? Où dans la protéine votre acide aminé non canonique est-il incorporé? L’expansion du code génétique nécessite au moins quatre composants différents. Quelles sont ces composants? Où doivent-ils être? Comment sont fabriqués ces composants? Que se passerait-il si l’un de ces composants manquait? Par exemple, que se passerait-il si l’acide aminé non canonique n’était pas ajouté dans vos milieux? Ou si la synthétase de l’ARNt orthogonal était manquante ou si une synthétase d’ARNt orthogonal incompatible était ajoutée? Réfléchir à ces questions peut également vous aider à résoudre vos problèmes d’expression si les choses ne semblent pas se passer comme prévu. |
Le manuel Bio-Rad Mini Protean Tetra Cell (en particulier la section 4.2) contient des protocoles pour la fabrication de solutions mères pour les gels et tampons pour la SDS-PAGE en Laemmli discontinu).
|
Réflexions approfondies sur la technique stérile Le maintien d’une technique stérile est un élément clé du travail avec E. coli et la biologie moléculaire en général. Vous voulez que votre E. coli puisse pousser, et rien d’autre. Mais les germes sont partout! Et qu’est-ce qui ne voudrait pas pousser dans un bouillon agréable, chaud et aéré riche en nutriments? Afin d’empêcher d’autres choses de croître, nous utilisons la technique stérile (c.-à-d. tuer tout ce que nous ne voulons pas avec la chaleur ou l’éthanol). Pratiquer une bonne technique stérile vous aidera avant tout dans le cadre du laboratoire. Mais au-delà de ce cours de laboratoire, la technique stérile peut s’avérer utile pour vous. Considérez n’importe quel type de pratique médicale, que vous soyez pré-médecine, pré-dentaire, ou quelqu’un qui visitera probablement un médecin à un moment de sa vie, la technique stérile limite la propagation des agents pathogènes et réduit vos chances de développer une maladie nocive. Réfléchissez soigneusement à la façon d’organiser votre espace de travail et vos outils pour maintenir la stérilité. |
